ChIP on Chip: surprising results are often artifacts

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The method of chromatin immunoprecipitation combined with microarrays (ChIP-Chip) is a powerful tool for genome-wide analysis of protein binding. However, a high background signal is a common phenomenon.</p> <p>Results</p> <p>Reinvestigation of the chromatin immunoprecipitation procedure led us to discover four causes of high background: i) non-unique sequences, ii) incomplete reversion of crosslinks, iii) retention of protein in spin-columns and iv) insufficient RNase treatment. The chromatin immunoprecipitation method was modified and applied to analyze genome-wide binding of SeqA and σ³²in <it>Escherichia coli</it>.</p> <p>Conclusions</p> <p>False positive findings originating from these shortcomings of the method could explain surprising and contradictory findings in published ChIP-Chip studies. We present a modified chromatin immunoprecipitation method greatly reducing the background signal.</p

Replication fork movement and methylation govern SeqA binding to the Escherichia coli chromosome

In Escherichia coli, the SeqA protein binds specifically to GATC sequences which are methylated on the A of the old strand but not on the new strand. Such hemimethylated DNA is produced by progression of the replication forks and lasts until Dam methyltransferase methylates the new strand. It is therefore believed that a region of hemimethylated DNA covered by SeqA follows the replication fork. We show that this is, indeed, the case by using global ChIP on Chip analysis of SeqA in cells synchronized regarding DNA replication. To assess hemimethylation, we developed the first genome-wide method for methylation analysis in bacteria. Since loss of the SeqA protein affects growth rate only during rapid growth when cells contain multiple replication forks, a comparison of rapid and slow growth was performed. In cells with six replication forks per chromosome, the two old forks were found to bind surprisingly little SeqA protein. Cell cycle analysis showed that loss of SeqA from the old forks did not occur at initiation of the new forks, but instead occurs at a time point coinciding with the end of SeqA-dependent origin sequestration. The finding suggests simultaneous origin de-sequestration and loss of SeqA from old replication forks

Functionality of Two Origins of Replication in Vibrio cholerae Strains With a Single Chromosome

Chromosomal inheritance in bacteria usually entails bidirectional replication of a single chromosome from a single origin into two copies and subsequent partitioning of one copy each into daughter cells upon cell division. However, the human pathogen Vibrio cholerae and other Vibrionaceae harbor two chromosomes, a large Chr1 and a small Chr2. Chr1 and Chr2 have different origins, an oriC-type origin and a P1 plasmid-type origin, respectively, driving the replication of respective chromosomes. Recently, we described naturally occurring exceptions to the two-chromosome rule of Vibrionaceae: i.e., Chr1 and Chr2 fused single chromosome V. cholerae strains, NSCV1 and NSCV2, in which both origins of replication are present. Using NSCV1 and NSCV2, here we tested whether two types of origins of replication can function simultaneously on the same chromosome or one or the other origin is silenced. We found that in NSCV1, both origins are active whereas in NSCV2 ori2 is silenced despite the fact that it is functional in an isolated context. The ori2 activity appears to be primarily determined by the copy number of the triggering site, crtS, which in turn is determined by its location with respect to ori1 and ori2 on the fused chromosome

RNA-Thermometer in Bakterien

Die Wahrnehmung von Umweltparametern ist für Bakterien von großer Bedeutung. RNA-Thermometer liegen in der 5'-untranslatierten Region von Genen. Sie kontrollieren die Translation durch eine temperaturabhängige Blockierung der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Die Datenbank RNA-SURIBA wurde konstruiert und durch eine strukturbasierte Motivsuche über 20 neue ROSE-ähnliche RNA-Thermometer gefunden. Eine temperaturkontrollierte Translation wurde für Kandidaten aus $\textit {Caulobacter crescentus}$, $\textit {Escherichia coli}$ und $\textit {Salmonella typhimurium}$ bestätigt. Zusätzlich werden diese Gene auf transkriptioneller Ebene reguliert. Durch Reporter-Gen-Analysen und Strukturkartierungsexperimente des RNA-Thermometers ROSE$_{ibpA}$ aus $\textit {E. coli}$ konnte ein Schmelzen der SD-Region in Abhängigkeit von der Temperatur gezeigt werden. Ein neuer RNA-Thermometertyp wurde im 5'-UTR des $\textit {Salmonella agsA}$-Gens entdeckt. Die Kontrolle hängt von einer Reihe von vier Uridinen ab, weshalb der Name "fourU-Thermometer" eingeführt wurde.Sensing of environmental parameters is of importance for bacteria. RNA thermometers are located in the 5'-untranslated region of heat shock and virulence genes. They control translation by temperature-dependent sequestration of the Shine-Dalgarno (SD) sequence. The database RNA-SURIBA was established to perform structure-based searches for RNA thermometers. More than 20 new ROSE-like RNA thermometers were found. Temperature-controlled translation was confirmed for $\textit {Caulobacter crescentus}$, $\textit {Escherichia coli}$ and $\textit {Salmonella typhimurium ibpA}$ genes. Additional transcriptional control was due to $\sigma_{32}$-type promoters. Reporter gene analysis and structure probing experiments of the RNA thermometer ROSE$_{ibpA}$ from $\textit {E. coli}$ demonstrated a temperature-controlled melting of the SD region. A new type of RNA thermometer was identified upstream of the $\textit {Salmonella agsA}$ gene. Translational control depends on a stretch of four uridines that pair with the SD sequence leading to the name "fourU" thermometers

Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung des synthetischen, sekundären Chromosoms synVicII in Escherichia coli

Synthetische, sekundäre Chromosomen sind ein wertvolles Werkzeug, um Chromosomenorganisationssysteme zu untersuchen. Anhand ihres Designs, ihrer Assemblierung und ihrer Charakterisierung können auch wichtige Konstruktionsregeln für synthetische Chromosomen abgeleitet werden. In der Biotechnologie könnten außerdem synthetische, sekundäre Chromosomen genutzt werden, um Mikroorganismen genetisch zu verändern. Für alle Anwendungen ist es wichtig, dass das verwendete synthetische, sekundäre Replikon gut charakterisiert und beschrieben worden ist. In dieser Arbeit wurde das synthetische, sekundäre Chromosom synVicII im monochromosomalen Bakterium Escherichia coli etabliert und charakterisiert. Als Vorbild für synVicII diente das natürlich vorkommende sekundäre Chromosom II von Vibrio cholerae, einem Bakterium, welches zwei unterschiedlich große Chromosomen besitzt. So wurden der Replikationsursprung des zweiten V. cholerae Chromosoms oriII, das Initiatorgen rctB und das eigene Chromosomen II Segregationssystem parABII in synVicII integriert. Transformation in E. coli bewies, dass synVicII erfolgreich in E. coli replizieren kann. Für die effiziente Assemblierung, Modifizierung und den Transfer von synVicII wurden verschiedene Elemente eingebaut: Beispielsweise macht ein integrierter oriT synVicII konjugierbar, ein Hefereplikationsursprung und ein Selektionsmarker erlauben die Assemblierung in S. cerevisiae und eine Flp-FRT-Kassette erlaubt die Entfernung von nur für die Konstruktion wichtigen Elementen. SynVicII wurde ModularCloning kompatibel entwickelt, sodass schnell und effizient neue DNA-Sequenzen eingebaut werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde synVicII auf wesentliche Charakteristika bakterieller Chromosomen wie die Stabilität, die Kopienzahl und die genetische Integrität untersucht. Mit einem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest konnte gezeigt werden, dass synVicII deutlich stabiler als ein oriC-basiertes Replikon, synEsc, ist. Ein Plattentest bestätigte die mit dem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest bestimmte Replikonverlustrate von synVicII. Der Plattentest demonstrierte auch, dass synVicII instabiler als ein 100 % stabiles synF-Plasmid ist. Mit einem neu entwickelten Evolutionsexperiment konnten neue stabilere synVicII-Varianten entwickelt und identifiziert werden. synVicII besitzt in E. coli eine vergleichbar niedrige Kopienzahl relativ zu oriC, was anhand von qPCR und Microarray-Analysen geklärt werden konnte. Die Kopienzahl-Analyse deutete sogar darauf hin, dass synVicII in E. coli ähnlich wie das zweite Chromosom in V. cholerae repliziert. Demnach startet synVicII vermutlich später die DNA-Replikation als das E. coli Chromosom. Southern Blot Analysen demonstrierten, dass synVicII im Gegensatz zu synEsc nicht in das E. coli Chromosom integriert. Neben sekundären Chromosomen könnten auch noch zusätzlich tertiäre Chromosomen in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Deswegen wurde die Diversität der sekundären Chromosomen von Vibrionaceae untersucht. Marker-Frequency-Analysen deuten darauf hin, dass alle sekundären Chromosomen in den 11 untersuchten Vertretern der Vibrionaceae die DNA-Replikation später initiieren als das erste Chromosom und beide Chromosomen zusammen terminieren. Neun neue synthetische Chromosomen mit verschiedenen Vibrionaceae Replikationsursprüngen wurden assembliert und ihre Eignung als tertiäres Chromosom initial getestet. Mit Konjugationstests wurde demonstriert, dass alle verwendeten Vibrionaceae Replikationsursprünge untereinander nicht kompatibel sind. Zusammengefasst besitzt synVicII mit seinen bisherigen charakterisierten Chromosomeneigenschaften schon großes Potenzial, um in der Grundlagenforschung und Biotechnologie eingesetzt werden zu können

Konstruktion synthetischer sekundärer Chromosomen zur Charakterisierung von DNA-Reparatur und Segregation in Escherichia coli

Alle Funktionen einer jeden Zelle sind im Genom kodiert, dieses wird in jeder Zellteilung – egal ob ein oder mehrere Chromosomen – gleich auf die Tochterzellen verteilt. Die Integrität des Genoms ist für das Überleben eines jeden Organismus essentiell. Durch die Methoden der Synthetischen Biologie werden umfangreiche Veränderungen an Genomen durchgeführt bzw. ganze Chromosomen synthetisiert, wobei der Fokus meist auf den kodierenden Sequenzen liegt. Chromosomen sind aber mehr als eine Aneinanderreihung von Genen. Chromosomen benötigen Systeme zur Replikation, Segregation, Organisation und Reparatur, was häufig über Wechselwirkungen von Proteinen mit DNA-Sequenzmotiven geschieht. Die vorliegende Arbeit studiert solche, als Chromosome Maintenance System bezeichnete Prozesse anhand von synthetischen sekundären Chromosomen in E. coli. Können die resultierenden Ergebnisse zum Verständnis der DNA-Replikation in Bakterien beitragen? Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte synthetische sekundäre Chromosom (synVicII) repliziert in E. coli wie das sekundäre Chromosom in V. cholerae, auf dem es basiert. Das Design wurde nach einer initialen Charakterisierung weiter optimiert. Ein entscheidender Schritt war die Herstellung einer Kompatibilität von synVicII mit dem hierarchischen DNA-Assemblierungssystem MoClo. Parallel wurde eine Vorgehensweise etabliert, um hochvariable, lange DNA-Sequenzen zu generieren, in denen benutzerdefinierte DNA-Sequenzen ausgeschlossen werden können. Die Insertion dieser DNA-Sequenzen in synVicII ermöglicht es, synthetische sekundäre Chromosomen mit einer Größe von 100 kb zu konstruieren. Dadurch konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals die Interaktion der DNA-Segregation und DNA mismatch Reparatur in vivo durch ein Set von drei synthetischen sekundären Chromosomen analysiert werden. Beide Prozesse sind auf das Vorhandensein hemi-methylierter GATC-Sequenzen angewiesen und die Arbeit zeigt, dass durch eine strukturierte GATC-Anordnung ein differenzielles Binden der beiden Proteine SeqA und MutH erreicht werden kann. Da die Funktionsweise von SeqA noch nicht vollständig verstanden ist, wurde außerdem das quantitative Verständnis von SeqA experimentell verbessert. Anhand der Daten wurde ein Modell der SeqA-Strukturen an den Replikationsgabeln generiert. Durch FRAP-Experimente konnte belegt werden, dass SeqA ein dynamisches Protein ist, welches zwischen zwei Bindeereignissen frei in der Zelle diffundiert. SeqA und Dam konkurrieren um die hemi-methylierten GATCs. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in einem konstanten Mengenverhältnis vorliegen. Dies könnte ein möglicher Aspekt zur Regulation der Re-methylierung der GATC-Sequenzen in E. coli sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dadurch signifikant zum Verständnis der DNA-Replikation in Bakterien bei

The Role of Genomic Context in Bacterial Growth Homeostasis

The growth of bacteria is a complex but well-orchestrated dance involving the repetitive and reproducible production of their diverse cellular components in order to divide. A lot can go astray and therefore the cell has developed several strategies in order to ensure everything remains synchronized. This problem is only further complicated as the cells adjust their growth rate to their living conditions resulting in ripple effects throughout the cell physiology. One notable change is that as nutrient availability and quality increases so too does the average size and the concentration of ribosomes in the cell. The latter enables the production of the largest macromolecule faction in the cell (proteins) including the production of more ribosomes required to maintain the protein synthesis requirements. With the increase in volume of the cell comes a required increase in surface area, and a disbalance between these two would result in untenable levels of internal pressure. How then do bacteria ensure that volume growth is synchronized with the production of cell envelope components so that cell homeostasis is maintained, especially in the face of fluctuating growth rate? Genomic context is known to assist in co-regulation of genes thereby synchronizing them to respond to different cellular stimuli. As the bacterial genome is highly fluid, the existence of conserved genomic contexts suggests important loci of co-regulation. Could it be in these gene clusters that a possible link between growth and surface expansion is found? To answer this question this thesis undertook three missions, firstly we established a genome comparison tool (www.GenCoDB.org) that will take advantage of the ever-growing availability of bacterial genomes to assist us in the analysis, comparison, and quantification of genome contexts. This will rely on novel strategies in order to: accommodate the breadth of genome data available in a computationally efficient manner, reduce the effect of sampling bias that plague most bacterial datasets and ensure candidates are considered significant for their evolutionary context. The availability of GenCoDB is sure to facilitate genomic context research in the microbiology community and improve accessibility to non-bioinformatics to this wellspring of important biological data. With the swath of genomic neighbourhood data, we then sought to understand and analyse the evolution of conserved gene clusters in order to narrow down possible volume-surface regulating candidates. By tracking the evolution of gene clusters throughout the Bacteria kingdom we found that co-orientation is strongly conserved, however, this does not influence the subsequent context around the cluster nor the expansion of the cluster. We found that vertical transmission and not horizontal gene transfer was found to be the driving factor of gene cluster occurrence in chromosomes and that the origin and terminus are hotspots for cluster maintenance. Finally, we found that despite the apparent frequency of operon organization in gene clusters, gene clusters appear to be maintained due to other selective pressures such as within-cluster protein-protein interactions and the essential status of their genes. We suggest that operons are a consequence and not a cause co-localization over evolutionary time. We identified a single gene cluster candidate that met all the requirements we believe are required for cell growth homeostasis of synchronized surface and volume expansion. These requirements were a broad conservation within Bacteria, and a connection between ribosome-associated proteins (growth) with cell envelope synthesizes. In agreement with our evolution studies we found that whilst the cluster was co-regulated this did not appear to be the selective pressure that brought these different processes together. Instead we found a potential role of genomic channelling, linking the production of pyrimidines with the synthesis of the cell envelope which is reliant on the co-localization of this cluster. Together, this work will forward the understanding of chromosome evolution in Bacteria and the potential implications of genomic context in metabolite utilization. It challenges the roles that operons and horizontal gene transfer play in the long-term evolution of gene order and it provides a new quantitative and statistical resource providing access to over 1.9 million gene neighbourhoods